.RU

Міністерство освіти І науки України Львівський національний університет імені Івана Франка На правах рукопису бабський андрій Мирославович - старонка 28

3.11. Використання

23

Na

-ЯМР-спектроскопії для одночасного моніторингу дифузії води у внутрішньо- та зовнішньоклітинному середовищі


Усі наведені дотепер у роботі дані дифузії води у пухлинах були наведені як загальнотканинний КДВ, який відображає сумарну реакцію дифузійних процесів у ЗКС, ВКС і, навіть, у судинах. На сьогоднішній день відсутні методи одночасної реєстрації дифузії води у внутрішньо- та зовнішньоклітинному просторі. Швидка дифузія води через плазматичну мембрану не дає змоги використовувати 1Н-ЯМР для цієї мети. Запропоновані дотепер методи реєстрації КДВ [290, 297, 298] за допомогою маркерів обох клітинних компартментів дозволяють реєструвати КДВ лише протягом послідовного, а не одночасного моніторингу. Ми запропонували для одночасного вимірювання КДВ 23Na-ЯМР-спектроскопію, яка, як вказували вище, дає змогу виокремити сигнали 23Na-ЯМР із ЗКС та ВКС з використанням реагентів зсуву. Іони Na+ завжди присутні у біологічних рідинах і їх рух корелює із рухом води у живій тканині.

У цих дослідах використовували реагент зсуву TmДОТФ5-, який вводили в організм щура через підщелепну вену. Через 30 хв пік Na+з-ЯМР у скелетних м’язах був зсунутий на 4 одиниці ррm відносно Na+в-піку. Як бачимо на

рис.

 

3.34,

навіть за високих значень b величин можна було виокремити 23Na-піки із ВКС і ЗКС. Це дозволило одночасно визначати коефіцієнт дифузії поза і усередині клітини. Дифузійні коефіцієнти у скелетних мязах виміряні за допомогою 23Na-ЯМР у ЗКС та ВКС за умов нормоксії виявились приблизно одинаковими. Глибока гіпоксія (аноксія), яку ініціювали введенням повітря у підщелепну вену, призводила до вірогідного зниження дифузійних процесів у міжклітинному середовищі на 20–25 % протягом 120–240 хв, залишаючи практично незмінними дифузійний коефіцієнти Na+в та води (

рис. 3.35

). Зміни коефіцієнту дифузії Na+ у міжклітинному просторі залежать від багатьох біофізичних та


Рис.

 

3.34.

 Спектри 23Na-ЯМР скелетних м’язів щура за різних b величин. Стрілками позначено піки 23Na-ЯМР із стандартного розчину (Na+ref), зовнішньо- (Na+з) та внутрішньоклітинного середовищ (Na+i)







фізіологічних показників [299], однак у нашому випадку найбільш доцільним поясненням його зниження є типове для ішемії набухання клітин, зменшення ЗКС, а також зміна форми ЗКС, яка утруднює дифузійні процеси у цьому середовищі. Відносна стабільність коефіцієнту дифузії Na+ усередині клітини може


Рис.

 

3.35.

 

Вплив тривалої ішемії на коефіцієнти дифузії води і Na+ у скелетних м’язах щура (M ± m, n = 5). Вірогідність: * Р < 0,05 (vs. до ішемії), ** Р < 0,05 (vs. Na+в )

бути пояснена збалансованістю процесів, які можуть як збільшувати цей показник, так знижувати його при ішемії, як от нагромадження клітиною води при набуханні і зменшення енергозалежного транспорту макромолекул, відповідно. Треба зазначити, що вимірювання дифузійних коефіцієнтів Na+т та води без TmДОТФ5- також показали підвищену чутливість дифузійних процесів Na+ порівняно із КДВ, які знижувались після ініціювання аноксії на 20 % і 10 %, відповідно (дані не наведені).

Окрім того, безпосереднє вимірювання [Na+] у цих тканинних компартментах підтвердило можливість використання 23Na-ЯМР як інтегрального показника метаболічних процесів у клітині. Так рівень [Na+]в зростав після ініціювання аноксії у 2,5 рази, відображаючи, у першу чергу, зменшення активності Na+/К+-АТФази в результаті припинення доступу кисню, а також активації Na+/Н+-обмінника в ацидифікованій аноксійній тканині м’язів (

рис. 3.36

). У свою чергу, [Na+]з зменшувався на 25 %, відображаючи зменшення трансмембранного Na+ градієнту за рахунок, в основному, входження іонів у клітину.


Рис.

 

3.36.

 

Вплив тривалої ішемії на [Na+]в, [Na+]з і [Na+]т у скелетних м’язах щура (M ± m, n = 5 ([Na+]т ) and 7 ([Na+]в і [Na+]з). [Na+]в і [Na+]з дані реєстрували із реагентом зсуву. Вірогідність: * Р < 0,05 (vs. до ішемії)

Отже, моніторинг інтенсивності сигналу 23Na-ЯМР дає змогу оцінити одночасно і дифузійні процеси усередині клітини та поза нею, і зміни трансмембранного іонного градієнту, які відображають біоенергетичні та іонні зміни при обмеженому доступу кисню до клітини.

* * *

У цьому розділі досліджували дію тривалої загальної гіпоксії (аноксії) на коефіцієнти дифузії води, Na+т, Na+з, and Naв+ у скелетних м’язах щура. З огляду на неможливість розмежування сигналів ЯМР, що надходять із ЗКС та ВКС, у літературі пропонується декілька ЯМР-маркерів цих двох клітинних компартментів. Сілва та ін. (Silva et al.) [300] запропонували використовувати інфузію контрастної речовини Gd(HP-DO3A) у шлуночки мозку для пригнічення зовнішньоклітинного сигналу води за дослідження ефектів фокальної церебральної ішемії на КДВ у загальній тканині та ВКС мозку щурів. Дуонг та ін. [299] вивчали коефіцієнт дифузії 2-[19F]тор-2-деоксиглюкозо-6-фосфату (ФДГ-6-Ф) у ЗКС та ВКС в ішемійному мозку щура за допомогою методу 19F-ЯМР. Автори використали інфузію ФДГ, яка перетворюється у ФДГ-6-Ф після проникнення у клітину, для оцінки дифузії у ВКС, а інфузію ФДГ-6-Ф, яка не проникає через плазматичну мембрану, для оцінки дифузії у ЗКС. Однак, для цього необхідно використовувати різні групи тварин для оцінки процесів дифузії у різних клітинних компартментах. Ці ж автори вивчали ефект ішемії мозку щурів на коефіцієнти дифузії манніту, фенілфосфату і поліетиленгліколю, як маркерів ЗКС.

Для правильної оцінки коефіцієнту дифузії у ЗКС та ВКС необхідно враховувати вплив транспорту води чи Na+ через клітинну мембрану. На відміну від води транспорт Na+ між ЗКС та ВКС є дуже повільним процесом завдяки низькій проникності катіону через мембрану [301]. Показано, що швидкість оуабаїн-чутливого виходу Na+ із еритроцитів становить ~ 1,8 ммоль/год /л клітин [95, 302, 303]. Припустивши, що [Na+]в є ~ 5.5 ммоль/л клітин, загальний час проникнення усіх Na+ (exchange lifetime) за цих умов становить ~ 3 год. Цей час є набагато тривалішим, ніж 10 мс часу дифузії, який ми використовували для вимірювання коефіцієнту дифузії Na+. Отже, проникність Na+ через мембрану не впливає на коефіцієнт дифузії цих катіонів у ЗКС та ВКС. Натомість, Пфайфер та ін. (Pfeuffer et al.) [304] і Жао та ін. (Zhao et al.) [305] показали, що загальний час проникнення молекул води через мембрану становить 15 мс і 120 мс, відповідно, що є співмірним із часом дифузії (33 мс), який ми використовували для вимірювання коефіцієнту дифузії води.

Іншою перевагою 23Na перед 1Н у реєстрації коефіцієнту дифузії у ЗКС та ВКС є, як зазначали вище, можливість розділення 23Na-сигналу у цих двох клітинних компартментах за допомогою реагенту зсуву TmДОТФ5-. Можливість реєструвати за цих умов два 23Na-сигнали служить додатковим доказом повільності транспорту Na+ через мембрану. Отже, особливості транспорту Na+ надають унікальну можливість одночасної реєстрації коефіцієнту дифузії у двох тканинних компартментах. Гудман та ін. (Goodman et al.) [306] на прикладі власних досліджень нормального та ішемійного мозку щурів стверджують, що коефіцієнт дифузії іонів Na+ вповні відображає КДВ.

Ми виявили, що значення коефіцієнтів дифузії Na+в і Na+з у скелетних м’язах мало відрізняються. Ці експериментальні результати не співпадають із загальноприйнятим уявленням, що КДВ у ЗКС є вищим порівняно до ВКС. Однак наші дані співпадають із експериментальнимим вимірюваннями Дуонг та ін. [299], які показали, що коефіцієнти дифузії ФДГ-6-Ф у ЗКС та ВКС мозку щурів схожі. Отже, експериментальні вимірювання виявили, що зміни тканинного КДВ не завжди можуть бути пояснені тільки простими відносними змінами ЗКС та ВКС. Хоча у наших експериментах зменшення коефіцієнту дифузії Na+т у скелетних м’язах після ішемії було викликане змінами коефіцієнту дифузії Na+з, а відтак перважно залежали від змін ЗКС. З іншого боку, Дуонг та ін. в ішемійному мозку щурів виявили зменшення коефіцієнту дифузій ФДГ-6-Ф і у ЗКС, і у ВКС [299].

Як було наведено вище, у наших експериментах коефіцієнт дифузії Na+т зменшувався на 25–30 % після 4 год ішемії м’язів, в той час як КДВ вірогідно не змінювався. Відмінності змін дифузії води і Na+ за ішемійних умов можуть бути пояснені їх різним перерозподілом у тканинних структурах. У м’язах, наприклад, [Na+] у ЗКС, яке займає 23 % усієї тканини [307] становить ~150 мМ, в той час як [Na+] у ВКС – 4,7 мМ [28]. Отже, більше, ніж 80 % тканинного 23Na-сигналу надходить із ЗКС. Іншим є розподіл води, 80 % якої розташовується саме у клітинах. Тому тканинний сигнал 23Na-ЯМР переважно надходить із ЗКС, а 1Н-сигнал води – із ВКС [306]. Як показали наші експерименти із реагентом зсуву 23Na-сигналу коефіцієнт дифузії Na+з вірогідно зменшувався на 34 % після 4 год ішемії, в той час як цей показник для Na+в вірогідно не змінювався. Отже, за відсутності реагента зсуву кофіцієнт дифузії для Na+т, який, як сказано вище, переважно формується у ЗКС, повинен зменшуватись, а КДВ, який переважно формується у ВКС, не повинен змінюватись. Це і було підтверджено у наших експериментах.

Найбільш чутливим показником дифузійних процесів в ішемійній тканині скелетних м’язів виявився коефіцієнт дифузії Na+з, який вірогідно зменшувався після 2–4 год ішемії. Достеменний механізм цього ефекту ще не є до кінця зрозумілий, але, на нашу думку, можливим поясненням могло б бути зростання т.зв. «звивистості» (tortuosity) ЗКС. Типові для ішемії зміни проникності мембрани, набухання клітин, зменшують відстані між зовнішніми мембранами клітин, збільшуючи «звивистість» ЗКС. Математичне моделювання (Monte Carlo simulation) дифузійних процесів у ЗКС показало, що коефіцієнт об’єму ЗКС α і фактор «звивистості» λ знаходяться у взаємозв’язку, що описується правилом Арчі (Archie’s law) λ = α-l, де l – величина «звивистості» (tortuosity exponent) [308]. Зменшення ЗКС та відповідне зменшення фактора «звивистості» корелювали за експериментального зменшення КДВ в ішемійному мозку [304]. Відсутність змін кофіцієнта дифузії Na+в протягом 4-х годин ішемії узгоджуються із результатами Лієсс та ін. (Liess et al.) [309], які показали, що КДВ в ізольованому перфузованому із KCl серці щура залишається незмінним протягом і після загальної ішемії серця. Однак зміни дифузійних процесів також і у ВКС були показані раніше на ішемійній моделі мозку щура [299, 310]. У наших експериментах причини змін дифузійних процесів у ВКС, що можуть призводити до збільшеня КДВ (зростання транспорту води у клітину чи розпад макромолекул у клітині), компенсувались, очевидно, факторами, що знижують КДВ (наприклад, зменшенням енерго-залежного руху цитоплазми).

Окрім дифузійних процесів у цій роботі також контролювали концентрацію Na+. Після 4-х год ішемії [Na+]в зростала із 2,8 дo 7,2 ммоль/кг сирої ваги, в той час як [Na+]з зменшувалась із 25,3 до 19,3 ммоль/кг сирої ваги. Отже, ішемія зменшувала співвідношення [Na+]з до [Na+]i із 9,1 (9:1) дo 2,7 (7:3). Викликане ішемією зростання [Na+]в було обумовлене обмеженням активності Na+/K+-ATФази і рухом Na+з у клітину. Сума [Na+]в і [Na+]з, виражена у ммолях/кг сирої ваги залишалась незмінною протягом експерименту. Це підтверджує нашу гіпотезу, що зменшення [Na+]з було викликано переважно входом Na+ у клітину. Хоча треба зазначити, що у дослідах без реагенту зсуву ми спостерігали незначне зростання [Na+]т після 3-х год ішемії. Це пояснюється тим, що хоча після смерті тварини перфузія органу зупиняється це не означає, що усі органи стають закритою системою. Рідини тіла можуть перерозподілятись відповідно до локальних змін тиску. Зокрема, наші попередні результати показали, що сигнали ЯМР від Na+в і Na+з у печінці зростають після смерті тварини [311]. Тому незначне зростання Na+т у скелетних м’язах не є зовсім несподіваним. Відсутність вірогідних змін суми [Na+]в + [Na+]з протягом ішемії може бути пояснене відносно високою стандартною похибкою цих даних, яка становила 8–11 % у розрахунку [Na+]в + [Na+]з величин і лише 2–3 % для [Na+]т значень.

Підсумовуючи цей розділ досліджень, слід підкреслити, що ми вперше продемонстрували на моделі ішемійних скелетних м’язів, що величини коефіцієнтів дифузії Na+ у ЗКС і ВКС є близькими. Коефіцієнти дифузії Na+т та Na+з знижувались після 4-х год ішемії, в той час як коефіцієнти дифузії води і [Na+]в вірогідно не змінювались. Це свідчить про те, що викликане ішемією зменшення дифузії Na+ у тканині спричинені змінами біофізичних характеристик у відповідних такнинних компартментах і не можуть бути пояснені простою зміною ЗКС та ВКС, як прийнято вважати. Зміни коефіцієнтів дифузії Na+т і Na+з протягом ішемії корелюють між собою завдяки високій концентрації Na+ у ЗКС. Подібним чином корелюють ішемійні зміни коефіцієнтів дифузії води і Na+в оскільки клітини займають 80 % тканини скелетних м’язів. Зменшення дифузії Na+з може бути викликане збільшенням «звивистості» ЗКС. Повільний час обміну іонів Na+ у клітинній мембрані дає змогу вимірювати коефіцієнти дифузії у різних тканинних компартментах чого неможливо зробити за моніторингу КДВ. Отже, використання реагенту зсуву спектрального сигналу 23Na-ЯМР може бути використане для вивчення механізмів змін дифузійних процесів за умов різних патологічних відхилень включно із неплазматичними перетвореннями та за їх терапії.
2010-07-19 18:44 Читать похожую статью
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • © Помощь студентам
    Образовательные документы для студентов.